Quelques images de mon laboratoire de microscopie

Laboratoire

Vue d'ensemble d'un petit laboratoire de microscopie amateur. S'il est possible de réaliser des observations au microscope avec très peu de matériel, les choses se compliquent dès que l'on souhaite aller plus loin. L'indispensable microscope, aux côtés du Précis de Microscopie de Langeron (1949, 7eme édition), la bible du microscopiste amateur.
Microscope BA 310 : trinoculaire (l'appareil photo est ici non monté), il dispose d'une tourelle à 5 objectifs et d'un dispositif de contraste de phase. Observation à l'objectif x100 d'une coupe de moelle épinière de rat colorée par la technique d'Azan (préparation du commerce). Le microtome de Ranvier, à droite, est un microtome à main qui avec un peu d'habitude, permet d'obtenir d'excellents résultats sur du matériel végétal. L'objet à sectionner est fixe, et le rasoir mobile.
Microtome rotatif de Minot à rasoir fixe, utilisée pour réaliser des coupes très fines (jusqu'à 5 microns) sur des objets mous inclus dans la paraffine. Détail du mécanisme interne du microtome de Minot. L'ingéniosité nécessaire à la réalisation d'un tel outil est bluffante. Panneau de commande de l'étuve utilisée pour l'imprégnation à la paraffine, le séchage des lames blanches ou certaines colorations spéciales. Il s'agit d'une étuve de bactériologique détournée ici de sa fonction d'origine.
Avec les fixateurs, les liquides éclaircissants, les colorants et les milieux de montage, le microscopiste fait un usage immodéré des produits chimiques. Les colorants, indispensables pour révéler les secrets des tissus végétaux et animaux. Capsule à bec et vase à peser en verre borosilicaté. La verrerie est également un allié très précieux du microscopiste.
Une tournette, utilisée pour luter certaines préparations (en particulier celles montées à la gélatine glycérinée). Préparations microscopiques : l'élégance des lames (centrage des objets, informations des étiquettes, etc.) est souvent une indication des beautés qui attendent l'observateur. La très grande majorité des ouvrages de référence utiles au microscopiste amateur datent d'au moins 50 ans. Plus aucun n'est édité aujourd'hui, ce qui en dit long sur notre société.

   
Une planche sur les desmidiées du traité de microscopie pratique de Georges Deflandre (seconde édition, 1947). Abondamment illustré de magnifiques dessins en noir et blanc ou en couleurs, c'est un livre qui procure aussi un grand plaisir à la lecture. Fruit d'un travail passionné et soigné, toute trace de médiocrité en est absente.    

Fixation des tissus

Quelques-uns des fixateurs les plus courants utilisés en microscopie : formaldéhyde à 5 % tamponné (fixateur universel), alcool formolé acétique (botanique) et picroformol de Bouin (histologie animale). Le rôle des fixateurs est de figer les structures cellulaires, d'empêcher l'autolyse et la putréfaction, et enfin de protéger les tissus des traitements agressifs qui vont ensuite avoir lieu. Prélèvement d'échantillons sur une fleur de Lys et fixation immédiate dans de l'alcool formolé acétique (les flacons ne sont pas encore étiquetés) : anthères à différents stades de maturité, ovaire et pistil. La récole en botanique est bien plus agréable et esthétique qu'en histologie animale ! Des myrtilles en cours de fixation dans de l'alcool formolé acétique, ou FAA (48 heures). Quelque soit sa nature, le ratio fixateur | échantillon doit être d'au moins 10 (idéalement 20), et il faut veiller à changer régulièrement le liquide. Les échantillons ne doivent pas non plus être trop épais, et ils sont donc coupés si nécessaire.

   
Le picroformol de Bouin, un mélange d'acide picrique, de formaldéhyde, d'acide acétique et d'eau est l'un des fixateurs les plus efficaces en histologie animale. L'acide picrique colore les pièces en jaune, ce qui permet non seulement de contrôler la profondeur de pénétration du fixateur dans les tissus, mais également de pouvoir repérer plus facilement l'objet à couper dans le bloc de paraffine. Le temps de fixation ne doit pas dépasser 24 à 48 heures, et contrairement au FAA, le Bouin ne peut pas servir de liquide de préservation longue durée. Les objets doivent donc être rapidement transférés dans l'alcool.    

Déshydratation

 
Pour l'inclusion en paraffine (indispensable pour pouvoir couper des tissus mous), les échantillons doivent être déshydratés en passant dans différents bains d'alcool de concentration croissante (70 %, 90 % et trois passages dans du 100 %), puis dans du toluène (deux bains). C'est une étape ingrate et fastidieuse, et les laboratoires professionnels utilisent des automates pour cette raison. Le passage dans du toluène est essentiel pour permettre l'imprégnation par la paraffine. Cette dernière est effectivement soluble dans le toluène, mais pas dans les alcools qui ont servi à ôter toute trace d'eau. Lors des bains de toluène (qui doivent rester courts), l'échantillon devient transparent, c'est l'éclaircissement.  

Inclusion (paraffine)

Une fois l'échantillon déshydraté (ici des myrtilles), il doit finalement être imprégné puis inclus dans de la paraffine. L'utilisation de moules (ici en métal) et de cassettes d'histologie facilite grandement cette étape. Hors de l'étuve, une petite plaque chauffante s'avère très pratique pour maintenir la paraffine à l'état liquide. Les laboratoires professionnels font usage de distributeurs de paraffine. Celle généralement utilisée en histologie possède un point de fusion situé entre 56°C et 58°C. Le problème, lorsque l'on travaille avec la paraffine, est de la maintenir liquide. Les pinces, qui servent à saisir ou plonger les spécimens lors de l'inclusion, doivent ainsi être régulièrement réchauffées avec un chalumeau. Sinon, la paraffine prend rapidement en masse, et il est alors particulièrement difficile de garder son calme !

Un refroidissement rapide des cassettes après inclusion des spécimens dans la paraffine peut être obtenu en plongeant ces dernières dans de l'eau froide ou de la glace pilée. Le démoulage est également considérablement facilité lorsque les cassettes sont très froides. Cassettes d'inclusion avec un moule en métal réutilisable à gauche, et un moule en plastique à usage unique à droite. Les mêmes cassettes une fois démoulées et étiquetées. La quantité de paraffine versée dans la partie supérieure de la cassette (à gauche) ne doit pas dépasser des bords, sans pour autant se réduire à une couche trop mince. Si de la paraffine recouvre les bords des cassettes, il est nécessaire de l'ôter avec un couteau émoussé, sous peine de ne pouvoir fixer ces dernières correctement sur la pince rapide du microtome.

   
Si les cassettes d'inclusion sont très pratiques, d'autres moules peuvent être mis en œuvre pour la réalisation des blocs de paraffine. La technique la plus ingénieuse consiste à utiliser des barres de Leuckart. Il s'agit de deux équerres métalliques, qui, lorsqu'elles sont placées face à face sur une plaque en acier, permettent de définir un volume parfaitement adapté au spécimen à inclure.    

Coupes fines

Un microtome de Ranvier à main (échantillon fixe, rasoir mobile), avec ses accessoires : moelle de sureau naturelle ou synthétique, couteau à manche et lames de rasoir jetables (avec un porte lame adapté). Il convient parfaitement pour la plupart des coupes végétales. L'utilisation de lames de microtome jetables permet d'éviter la fastidieuse opération d'affutage sur cuir des couteaux. C'est également l'assurance d'avoir toujours à disposition des lames très coupantes. Le microtome de Minot est indispensable pour réaliser des coupes fines d'objets mous inclus dans la paraffine. Une cassette est ici montée sur la pince rapide à cassettes, et sa surface s'apprête à être dégrossie. L'objectif est d'amener la zone du spécimen à étudier dans le plan de coupe, puis de polir la surface du bloc de paraffine.

Blocs de paraffine (dégrossi ou non), renfermant différents spécimens du monde végétal et animal. Une fois que l'on a commencé ainsi à étudier la Nature, il est impossible de s'arrêter, car il y a toujours quelque chose d'intéressant à couper. Lorsque la zone voulue d'un bloc est exposée, il est temps de passer aux coupes proprement dit. Une lame neuve a été montée sur le porte lame, tandis que la surface du bloc a été refroidie avec de la glace. Une fois ce bloc remonté puis remis en contact avec la lame, la montée et descente du porte-échantillon donne naissance à un ruban de coupe plissé, très fragile et délicat à manipuler (l'épaisseur de coupe est ici de 5 microns). Ruban de paraffine débité sur un bloc de paraffine contenant un bourgeon floral d'Ancolie orienté transversalement, avec une épaisseur de 7 microns. Notez les plis, inévitables. Les coupes sont séparées les unes des autres (en bas à gauche) en utilisant une aiguille fine et une aiguille lancéolée.

Pour ôter les plis des coupes de paraffine, il est possible d'utiliser soit un bain marie de flottaison, soit (comme ici) une platine chauffante. Une ou plusieurs coupes sont portées sur une lame, sur laquelle quelques gouttes d'albumine glycérinée à 1 % ont été déposées. La lame est ensuite placée sur une platine chauffante, et l'étalement contrôlée à l'œil nu. Sur cette photo, la coupe située au premier plan n'est pas encore totalement défroissée. Celle du milieu est correctement étalée, et celle en arrière-plan a subi un chauffage trop important pour être utilisable (destruction totale des structures cellulaires). La température doit toujours être inférieure d'au moins 10°C à celle du point de fusion de la paraffine.

Une fois l'étalement effectué, les lames sont mises à sécher en position verticale sur un portoir adapté. Il est possible d'accélérer le processus à l'étuve, mais quel que soit la technique retenue, il est impératif de s'assurer que les lames sont parfaitement sèches avant de commencer le déparaffinage, l'hydratation et enfin la coloration.

Le traitement des lames commence par une étape de déparaffinage. Les lames sont immergées dans un bain de toluène (ici il s'agit de coupes de caryopse de blé), qui va dissoudre la paraffine. Les préparations sont ensuite portées dans un bain d'alcool absolu, puis des alcools de concentration décroissante, pour finir par de l'eau pure. Ainsi réhydratés, les tissus sont alors prêts pour la coloration. Notez qu'il s'agit d'une séquence inverse à celle qui a permis l'inclusion dans la paraffine. Les tissus seront à nouveau complètement déshydratés pour le montage entre lames et lamelles.

Coloration

Les colorants les plus utilisés pour la coloration des frottis sanguin : May Grünewald - Giemsa, Leishman (très utilisé en Grande Bretagne), et l'indispensable tampon alcalin. En bactériologie, la coloration la plus utilisée est la coloration de Gram, qui consiste à traiter un frottis avec un colorant violet (ici du violet de gentiane), à mordancer avec de l'eau iodée (lugol), puis à différencier à l'alcool et enfin à contre-colorer avec un colorant rose (ici de la Fuchsine de Ziehl). En botanique, le carmino-vert de Mirande (carmin aluné et vert d'iode) est le colorant classique, avec la technique Safranine / Fast Green. D'autres colorants plus modernes peuvent être utilisés avec intérêt. C'est le cas des Etzold bleu et vert et surtout du Wacker, qui donne des résultats magnifiques.
Contrairement à l'histologie végétale, l'histologie animale s'appuie sur de très nombreux colorants. La coloration la plus classique est celle de l'hématoxyline éosine (HE). L'hématoxyline existe sous de multiples formulations, qui peuvent être régressives (sur-coloration puis différentiation avec de l'alcool acidifié) ou progressives (arrêt de la coloration lorsque le résultat est jugé satisfaisant). Certaines formulations sont prêtes à l'emploi, tandis que d'autres sont préparées juste avant utilisation. Pour ma part, j'utilise principalement l'hématoxyline de Harris, mais d'autres conviennent mieux pour des études cytologiques, ou les tissus végétaux. Cependant, quelque soit la formulation, le principe de coloration reste toujours le même : l'hématoxyline est oxydée (grâce à un agent oxydant) en hématéine, qui se fixe sur certaines structures grâce à un mordant métallique (aluminium ou fer). La contre-coloration s'effectue avec de l'éosine, qui est généralement employée en solution aqueuse. Cette étape n'est cependant pas aussi simple qu'il y paraît, car de nombreux facteurs rentrent en jeu, comme le pH de l'éosine, le pH de l'eau de lavage, ou encore la durée et la concentration des bains d'alcool qui suivent la coloration. Si la différentiation des différentes structures (muscles, fibres de collagènes, cytoplasmes, globules rouges) n'est pas assez prononcée, ou si la coloration est trop pâle, il peut être utile d'opter pour de l'éosine en solution alcoolique, ou mieux des mélanges avec d'autres principes colorants (phloxine, érythrosine, orangé G). En France, la coloration à l'hématoxyline/éosine est souvent complétée par du safran (HES). Des colorants spéciaux peuvent aussi être employés dès qu'il s'agit de mettre en évidence certaines structures spécifiques (comme les fibres de collagène pour le Van Gieson, les fibres élastiques avec le Miller, le mucus avec le bleu alcian, etc.). En histologie animale, certaines colorations demandent de nombreux réactifs parfois délicats à trouver. C'est le cas du trichrome d'Azan, qui est une coloration magnifique lorsqu'elle est réussie, mais qui demande cinq réactifs différents. Contrairement à la coloration de routine hématoxyline/éosine, les trichromes sont des colorations qui mettent en œuvre trois colorants (l'objectif étant d'augmenter la différentiation des structures), et qui sont généralement plus longues et complexes. Sur la photographie ci-dessus, des coupes de lombric sont actuellement au stade de mordançage par de l'acide phosphotungstique dans une jarre de Coplin en polypropylène.

   
Deux des principes colorants les plus utilisés en microscopie sont naturels et proviennent d'êtres vivants: l'hématoxyline (extrait du bois de campêche) et le carmin (aimablement fourni par les cochenilles). Ce ne sont cependant pas les seuls, et il est ainsi possible d'utiliser tout simplement du jus de myrtille (mélangé à de l'alcool) pour pouvoir colorer facilement les noyaux cellulaires et les chromosomes.    

Certains colorants (ici de l'hématoxyline de Harris) doivent être filtrés régulièrement, sous peine de contaminer les lames avec des dépôts de précipitation. Cuve en verre adaptée à la coloration de lames individuelles, avec portoir en fil plastifié. Ce type de cuve convient aussi parfaitement pour les frottis sanguins et les préparations bactériologiques. Pour traiter des coupes végétales, que l'on manipule avec un pinceau fin, on peut utiliser un plateau de coloration en porcelaine. Très pratique, ce dernier permet de réaliser la plupart des étapes, dont la coloration.

Batterie de  tubes cylindriques de Borel (avec prisme) et cuve de Coplin. Ces jarres permettent de colorer un petit nombre de lames (de 3 à 5) tout en faisant des économies de colorants. Cuves de coloration rectangulaires de Hellendahl et de Schiefferdecker, avec ou sans support. Ces cuves permettent de traiter une dizaine de lames par bain. Pour colorer un plus grand nombre de lames, il est possible d'utiliser des rampes de coloration. Le modèle présenté ici possède un panier d'une capacité de 25 lames, et douze bacs d'un volume de 300 ml. Les laboratoires professionnels possèdent souvent des automates de coloration.

   
Après chaque session de travail, il est particulièrement important de laver soigneusement la verrerie ainsi que les instruments à l'eau savonneuse, avant de rincer le tout à l'eau distillée. S'ils sont astreignants, ces lavages permettent d'éviter les problèmes liés à des contaminations (des produits chimiques ou des spécimens entre eux), et offrent de plus le plaisir de travailler avec du matériel propre. Cette remarque s'applique également au microscope et au microtome, qui doivent être nettoyés après chaque utilisation.    

Montage

La réalisation de préparations définitives nécessite des lames de verre (bords bruts ou rodés, coins coupés ou non, avec ou sans zones dépolies pour le marquage, à concavités, etc.) et des lamelles. Il est idéal d'en avoir un assortiment de différentes formes et dimensions (carrées, rectangulaires ou rondes). J'avoue une certaine prédilection pour ces dernières, qui rendent les préparations plus jolies. Il existe de nombreux milieux de montage : le plus facile à utiliser est la gélatine glycérinée, même si elle nécessite une étape de lutage. D'autres milieux plus efficaces à long terme exigent une déshydratation des échantillons et un passage dans le toluène : c'est le cas du Baume du Canada et de ses substituts. L'Euparal permet de sauter cette dernière étape, et accepte les échantillons directement à la sortie des alcools absolus. Le naphrax est un milieu de montage à haut indice de réfraction, adapté aux diatomées. L'étape finale de la fabrication d'une préparation définitive est d'effectuer le montage de l'objet entre lame et lamelle (en évitant autant que possible les bulles). Une fois que la préparation est sèche, il est ensuite nécessaire de l'étiqueter soigneusement, en renseignant au minimum la nature de l'objet et la coloration, et si possible le milieu de montage et la date.
 
Les lames montées à la gélatine glycérinée doivent être lutées avec des vernis spéciaux (historiquement, du lut au bitume de Judée était utilisée). L'opération est grandement facilitée en utilisant une tournette. La tournette en action. L'opération consiste à déposer une fine couche de vernis sur le bord de la lamelle ronde qui protège le spécimen monté.  

Pour débuter, et contrairement à ce que l'on entend souvent, il peut être très avantageux de se constituer une collection de préparations du commerce : non seulement certaines préparations sont totalement hors de portée de l'amateur, mais en plus, de nombreuses lames (en particulier celles d'histologie animale et humaine), en suscitant la curiosité, peuvent se révéler très inspirante. Combien d'amateurs ont abandonné leur microscope à la poussière, après avoir observé un épiderme d'oignon et les infusoires dans l'eau d'un vase ? Les lames du commerce constituent également une référence intéressante pour l'amateur, qui peut alors jauger ses progrès de manière concrète en travaillant sur des sujets qu'il possède déjà en collection. Bien entendu, il est également très satisfaisant de constituer ses propres collections, d'autant que selon le milieu de montage utilisé, les lames peuvent traverser le temps. Il est évident qu'entre une lame achetée dans le commerce et une lame entièrement réalisée à la main, depuis la collecte du spécimen jusqu'au montage final, le potentiel de connaissance qu'il est possible d'acquérir est incomparable. L'investissement n'est pas non plus le même, que ce soit en termes d'efforts et de persévérance, de budget ou de temps. Détail de l'une des boites de préparations de l'auteur. La plupart des lames de cette boîte ont plus de 30 ans, et ont été réalisées alors que j'avais 15 ans. Montées dans du baume du Canada, elles procurent un plaisir intact à l'observation. Les moyens à ma disposition étant à l'époque limités, je consacrais surtout mon temps à l'étude des insectes, tout en réalisant également quelques coupes végétales. Paradoxalement, il était bien plus aisé de se procurer les produits chimiques indispensables au microscopiste que maintenant.

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